近期大热的RNA修饰m6A研究,竟然只需三步!

发表于 讨论求助 2019-06-12 10:06:21


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作者:小又

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如果要评2017年RNA领域最火热的研究,m6A修饰一定榜上有名!这不,2017年还未过完,RNA m6A的研究就已多次登上nature, cell, cancer cell等许多著名杂志,涉及领域从RNA翻译效率到DNA损伤修复,从生长发育到肿瘤形成,m6A的影响力可见一斑。



然而,m6A的研究才刚刚开始,还有很多空白,还有很多值得探索的问题。小伙伴们是不是摩拳擦掌,跃跃欲试却又不知关于RNA m6A的研究该从哪下手呢?不用担心,跟着小又,只需三步,带你玩转RNA m6A修饰研究!


一图看懂RNA修饰


磨刀不误砍柴工,步入正题前,一幅图让大家了解什么是RNA m6A修饰。



如上图,m6A是mRNA上最丰富的甲基化修饰,指碱基A第6位N原子上的甲基,主要存在于mRNA的CDS区和3‘UTR区,影响mRNA的稳定性,翻译效率,可变剪接和定位等。此外,长非编码RNA以及microRNA等非编码RNA也存在m6A位点。


RNA甲基化分子机制


RNA甲基化过程需要三类分子参与:Writers, Erasers和Readers。



Writers:在RNA加上甲基,介导RNA的甲基化修饰过程。干这活的是甲基转移酶,最常见的分子是METTL3和METTL14,两者可在体外和体内催化mRNA(和其他细胞核RNA)的m6A甲基化。WTAP是这种甲基转移酶复合体中的另一个关键组分。


Erasers:将RNA上甲基去除,介导RNA的去甲基化修饰过程。FTO和ALKBH5可以去除mRNA(和其他细胞核RNA)上的m6A甲基化。


Readers:识别RNA甲基化修饰的信息,并参与下游RNA的翻译、降解等过程。比如,YTHDC1可与mRNA上的m6A修饰,促进mRNA出核运输与可变剪接。YTHDF1/YTHDF3识别m6A后可促进mRNA的翻译,而YTHDF2与m6A的结合则会促进mRNA的降解。


RNA甲基化研究实例


接下来,以一篇今年初发表在cancer cell上的文章为例,带大家解析m6A研究的三步套路。



由上文的m6A简介可以看出,m6A由相应的蛋白酶完成,那么,要研究m6A在某一体系中的作用,也要从m6A相关蛋白酶下手。研究者通过整理之前的RNA芯片数据,发现FTO(m6A去甲基化酶)在特定的急性髓系白血病中高表达,并且通过质谱检测发现,在含MLL-AF9融合蛋白的白血病中,m6A的整体水平比对照组低。



那么,FTO在特定白血病亚型中的高表达,是否是其发挥了癌基因的功能呢?通过构建稳定敲低FTO的细胞系,研究者在细胞实验和动物实验中证明,敲低FTO可以显著抑制肿瘤细胞的增殖以及延长实验小鼠的生存时间。



接下来,就是文章的重点和难点——FTO发挥癌基因作用的具体机制是什么?关于机制的探索,这不仅是m6A研究的重点,相信也是每个课题都要面对的问题。幸运的是,FTO做为m6A的去甲基化酶,功能是相对确定的,要寻找FTO的具体作用机制,实际上是寻找FTO靶向的mRNA。


这里不得不提到的是m6A-seq技术,该技术通过用m6A特异的抗体将含m6A修饰的mRNA从总mRNA中富集出来,再结合高通量测序技术,就可以知道哪些mRNA含有m6A修饰。


研究者通过对过表达FTO和正常样品的m6A-seq测序,发现了一批在过表达FTO后m6A修饰减少的基因,然后结合普通RNA测序,发现这些m6A减少的mRNA在表达量上也发生了变化。


研究者从变化倍数以及基因本身的功能着手,最终锁定了两个基因:ASB2和RARA并认为它们是FTO最主要的靶标,并在western blot实验以及双荧光素酶实验中得到了验证。End。



文章解析到这,相信大家也已经看出了m6A研究的三步套路


1.寻找m6A相关酶在某一体系(疾病)中的异常表达情况。鉴于mRNA的测序和芯片数据较全,建议大家从数据库中寻找,比如cbioportal,oncomime和GEO datasets等。


2.细胞及动物的表型实验。通过敲低和过表达该m6A修饰酶,检测细胞的变化,包括细胞增殖,凋亡,衰老等指标。


3.通过m6A-seq和RNA-seq的结合,寻找m6A含量变化和RNA分子数量变化最大的mRNA。这部分工作对生物信息学的要求较高,好在已有部分测序公司可以提供相关的分析。


以上,大家是否感觉cancer cell的文章也不是很难呢?这篇文章的亮点在于第一次在肿瘤中系统地研究了m6A去甲基化酶FTO的功能,并建立了较完善的研究方法,对后人的研究启发很大,也是一篇里程碑式的文章!


Q&A


现在,肿瘤中m6A的功能研究还有很多空白之处,小伙伴们看准了就赶紧下手吧!想到大家在研究中可能遇到的问题,小又在此先自问自答了。

1
  我研究的领域是XX癌,但是翻遍了各大数据库,都没发现METTL3/FTO和ALKBH5等m6A相关酶有差异表达,怎么办?m6A是不是跟我无缘了?


回答:要想和这样一个重要的RNA修饰擦肩而过,还真是挺难的。M6A甲基化酶在某一体系中即使没有异常表达,也不能说它们没有功能。


推荐这篇PNAS的文章,研究者通过阅读m6A文献,发现NANOG的mRNA有m6A修饰,而NANOG在乳腺癌中是一个非常重要的癌基因,猜测m6A是否会在NANOG介导的乳腺癌中发挥功能,并在通过实验验证了这一点。



2
   除了m6A-seq外是不是还有其他RNA甲基化的检测方法?


回答:RNA甲基化的研究才刚起步,因此现在RNA甲基化的检测方法并不多,大致有3种,除了m6A-seq之外还有miCLIP和SCARLET。


miCLIP是将含有m6A的RNA与相应抗体结合以后,通过紫外进行交联,反转录得到的cDNA会出现突变或者截断,这样就可以指示m6A的存在。该方法的分辨率为单核苷酸水平。


SCARLET则是通过结合位点特异性的RNA酶H、放射标记和TLC(薄层层析)的方法,对RNA甲基化修饰进行检测,该方法是从单基因通量下检测RNA的甲基化修饰。


3
  套路太简单了,想要做得更深,更有新意,该怎么办?


回答:欣赏你这样的有志少年!推荐也是今年发表在cancer cell上的文章,研究者发现m6A去甲基化酶ALKBH5通过影响FOXM1的功能,在恶性胶质瘤中扮演癌基因的角色,并创造性的将近年来火热的长非编码RNA纳入该研究,发现ALKBH5对FOXM1的选择性去甲基作用是通过长非编码RNA FOXM1-AS介导的。



点击阅读原文,可下载三篇文献


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