基因敲除技术展望

发表于 讨论求助 2018-12-05 17:38:31


世界上第一只基因敲除狗;研究团队敲除了狗肌肉生长抑制素基因(myostatin)。该基因功能为抑制骨骼肌生长,其被敲除后,肌肉生长发育能力增强,成年以后将具有更强的运动能力。

基因敲除策略

基因敲除(knockout)是指一种遗传工程技术,针对某个序列已知但功能未知的序列,改变生物的遗传基因,令特定的基因功能丧失作用,从而使部分功能被屏障,并可进一步对生物体造成影响,进而推测出该基因的生物学功能。从而实现为人类服务的目的。

研究意义

基因敲除实现了修饰改造染色体上某一基因的目的的一种技术。它克服了随机整合的盲目性和偶然性,是一种理想的修饰、改造生物遗传物质的方法。这项技术的诞生可以说是分子生物学技术上继转基因技术后的又一革命。它的发展将为发育生物学、分子遗传学、免疫学及医学等学科提供了一个全新的、强有力的研究、治疗手段,具有广泛的应用前景和商业价值。


基因敲除方法

基于同源重组的方式

利用DNA转化技术,将含有目的基因和靶基因同源片段的重组载体导入靶细胞,通过载体与靶细胞染色体上同源序列间的重组,将外源基因整合入内源基因组内,使外源基因得以表达。在大肠杆菌中最常用的是red重组系统。



RNA干扰引起的基因敲除

RNA干扰(RNA interference,RNi)是一种普遍的转录后基因沉默的机制,由siRNAsmall intereferenceRNA)引起,siRNA是外源基因产生的dsRNADicer酶的作用下所产生的长度为21-22nt的一系列片段的总称,具有很强的关闭基因的功能,能够介导RNA干涉现象,诱导出一种由siRNA分核酸酶以及螺旋酶等结合在一起的RNA诱导沉默复合物(RNA-inducedsilencingcomplex,RISC)。RISC能够解开siRNA并精确的指导特异mRNA降解。通过将dsRNA分了导入细胞内,特异性地降解细胞内与基同源的mRNA,封闭内源性基因的表达来失活该基因同样可以实现基因的敲除。


R
RNAi干扰机制


ZFNs

ZFNs-Zinc finger nucleases(锌指核酸酶)是人造限制性酶;它由两个模块组成:锌指DNA结合域、DNA剪切域。通过工程化锌指结构域可以定位到特定DNA序列;并在DNA剪切模块的作用下实现基因的剪切。若有必要可在目标基因两侧设计同源序列从而实现功能基因的整合。


Z
ZFNs作用机理


TALENs

TALENs(transcription activator-like (TAL)effector nucleases)是转录激活因子样效应物核酸酶,TALENs是一种可靶向修饰特异DNA序列的酶,它借助于TAL效应子一种由植物细菌分泌的天然蛋白来识别特异性DNA碱基对。TAL效应子可被设计识别和结合所有的目的DNA序列。对TAL效应子附加一个核酸酶就生成了TALENsTAL效应核酸酶可与DNA结合并在特异位点对DNA链进行切割,从而导入新的遗传物质。


T
TALENs作用机理


CRISPR-Cas9

CRISPR/Cas9是继锌指核酸内切酶(ZFN类转录激活因子效应物核酸酶(TALEN之后出现的第三代基因组定点编辑技术。与前两代技术相比,其成本低、制作简便、快捷高效的优点,让它迅速风靡于世界各地的实验室,成为科研、医疗等领域的有效工具。


C
CRISPR/Cas9系统灵感来源

01
CRISPR/Cas9技术的灵感来源于细菌的一种获得性免疫系统。与哺乳动物的二次免疫应答类似,细菌在抵抗病毒或外源质粒入侵时,会产生相应的“记忆”,来抵抗该种外源遗传物质的再次入侵,而这种获得性免疫正是由细菌的CRISPR/Cas系统实现的。

在细菌的基因组上,存在着串联间隔排列的“重复序列”,这些重复序列相对保守,我们称之为CRISPR序列(Clustered Regularly Interspersed Short Palindromic Repeats—成簇的规律间隔的短回文重复序列)。

1、“记录”入侵者档案

其中的“间隔序列”来源于病毒或外源质粒的一小段DNA,是细菌对这些外来入侵者的“记录”。


病毒或外源质粒上,存在“原间隔序列”,“间隔序列”正是与它们互相对应。“原间隔序列”的选取并不是随机的,这些原间隔序列的两端向外延伸的几个碱基往往都很保守,我们称为PAM(Protospacer adjacent motifs-原间隔序列临近基序)。

当病毒或外源质粒DNA首次入侵到细菌体内时,细菌会对外源DNA潜在的PAM序列进行扫描识别,将临近PAM的序列作为候选的“原间隔序列”,将其整合到细菌基因组上CRISPR序列中的两个“重复序列”之间。这就是“间隔序列”产生的过程。


2、打击二次入侵者

当外源质粒或病毒再次入侵宿主菌时,会诱导CRISPR序列的表达。同时,在CRISPR序列附近还有一组保守的蛋白编码基因,称为Cas基因。CRISPR序列的转录产物CRISPR RNACas基因的表达产物等一起合作,通过对PAM序列的识别,以及间隔序列与外源DNA的碱基互补配对,来找到外源DNA上的靶序列,并对其切割,降解外源DNA。这也就实现了对病毒或外源质粒再次入侵的免疫应答。

正是基于细菌的这种后天免疫防御机制,CRISPR/Cas9技术应运而生,从而使科学家们利用RNA引导Cas9核酸酶实现对多种细胞基因组的特定位点进行修饰。

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CRISPR/Cas9设计组装
02

CRISPR/Cas9技术中,我们把即将被编辑的细胞基因组DNA看作病毒或外源DNA。基因编辑的实现只需要两个工具——向导RNAguide RNA gRNA)和Cas9蛋白。

其中,向导RNA的设计并不是随机的,待编辑的区域附近需要存在相对保守的PAM序列(即三碱基序列NGG,其中N可以是任意碱基),而且向导RNA要与PAM上游的序列碱基互补配对。以基因敲除为例,在待敲除基因的上下游各设计一条向导RNA(向导RNA1,向导RNA2),将其与含有Cas9蛋白编码基因的质粒一同转入细胞中,向导RNA通过碱基互补配对可以靶向PAM附近的目标序列,Cas9蛋白会使该基因上下游的DNA双链断裂。

对于DNA双链的断裂这一生物事件,生物体自身存在着DNA损伤修复的应答机制,会将断裂上下游两端的序列连接起来,从而实现了细胞中目标基因的敲除。


C
CRISPR/Cas9作用机理



展望

基因敲除技术在医疗健康、生产生活、家畜育种等领域的应用,不断取得喜人的新成果。

如在医疗健康领域,用iPS细胞(诱导多能干细胞)治疗人类的镰刀形贫血症,可以将病人的皮肤细胞诱导成iPS细胞,利用CRISPR/Cas9技术介导同源重组来修复发生突变的血红蛋白基因,再将修复的iPS细胞定向诱导分化为造血干细胞移植到病人体内。此外,像使用CRISPR技术根除HIV病毒、诱导宫颈癌细胞自我毁灭、构建癌症模型等最新成果先后被Nature等著名杂志所报道。

相信在不久的将来基因敲除技术将会更加成熟,随着它的发展及进一步成熟,它必将带来生命科学史的巨变,造福人类。

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