间充质干细胞的归巢特性

发表于 讨论求助 2019-06-12 16:56:30


1867年,德国病理学家Cohnheimt首次提出假说,骨髓中可能存在非造血功能干细胞。1976年, Friedenstein 等证实了间充质干细胞的存在,同时创建了贴壁法体外分离培养间充质干细胞。间充质干细胞属于中胚层的一类多能干细胞,具有强大的增殖能力和多向分化潜能,在适宜的环境下不仅可分化为中胚层的成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞,还具有分化为内胚层和外胚层的肝细胞、神经细胞、胰岛细胞等多种细胞的能力。在机体调控下,间充质干细胞能够不断地由原组织位点向新的组织位点迁移,从而在生理或病理条件下参与组织、器官的更新和修复,以维持机体组织形态的完整性和功能的稳定性。 Saito等首次提出间充质干细胞具有归巢能力,当机体组织受到某种刺激时,一些“休眠”的间充质干细胞被“唤醒”,归巢到损伤部位进行分化,替代损伤的细胞。大量研究发现,当机体缺血、缺氧、损伤时,机体内或者外源性间充质干细胞具有向损伤部位优势分布的特质,提示间充质干细胞具有强大的迁移能力,同时间充质干细胞表面表达不同细胞因子受体,其与相应配体结合介导细胞迁移。目前的培养技术难以在短期内获得纯度较高的间充质干细胞,而一定数量归巢的间充质干细胞能够提高组织的修复作用,因此对归巢机制的深入研究以及提高干细胞归巢的效率显得相当迫切。



间充质干细胞的生物学特性 


间充质干细胞是一类具有自我更新、高度增殖、免疫调控、造血支持及多向分化潜能的非造血干细胞,最早在骨髓中发现,随后在多种组织中发现,如脂肪、脐带沃顿胶、脐血等。目前国际公认的人间充质干细胞表型特征为:细胞表面CD73、CD90、CD105等抗原呈阳性,而CD14、CD79a、CD11b、CD19、CD34、CD45、HLA-DR等表达阴性。大多数人类间充质干细胞可以作为中胚层组织如骨骼、脂肪和软骨发育的前体细胞,同时还可以跨越胚层横向分化为各种组织细胞,如神经细胞和内皮细胞等。 

间充质干细胞是一类低免疫原性的成体干细胞,间充质干细胞的低免疫原性与其低表达主要组织相容 性复合体MHC-Ⅰ而不表达MHC-Ⅱ、CD40、CD80、 CD86有关,同时间充质干细胞对各类免疫细胞均具有免疫调节作用。研究发现间充质干细胞可通过调节T细胞的活化和增殖来抑制免疫反应。间充质干细胞 对T细胞的调节可通过细胞间直接接触,亦可在非直接接触下间充质干细胞分泌可溶性因子来发挥作用。内源性间充质干细胞可产生相应的生长因子和细胞因子在组织修复过程中发生作用,如骨形态发生蛋白在骨、肌腱、软骨的修复中发挥作用,促血管再生因子可用于缺血性疾病的治疗。基因修饰的干细胞移植是目前临床研究的热点,因此,间充质干细胞的低免疫原性及促进机体修复的特点使其成为备受关注的可用于移植的干细胞之一,而移植的间充质干细胞能否顺利归巢至微环境,是决定间充质干细胞移植的成败之一。

 

间充质干细胞的归巢及归巢机制 


干细胞归巢是指自体或外源性干细胞在多种因素的作用下,能定向趋向性迁移,越过血管内皮细胞至靶向组织并定植存活的过程,类似人体局部炎症反应后大量白细胞迁移至炎症周围。2009年Krap等建议将“间充质干细胞归巢”定义为:间充质干细胞在目标组织的脉管系统里被捕获,随后跨越血管内皮细胞迁移至目标组织的过程。间充质干细胞与血管内皮细胞具有相似性,因而易于迁移和植入。干细胞“巢”作为一种特殊的微环境,是干细胞存在的基础,“巢”通过不同信号途径调控着干细胞的行为,使干细胞的生长、间充质干细胞表面广泛表达趋化因子和生长因子等受体,其归巢过程亦涉及趋化因子、黏附分子、生长因子和酶等多种配体及其受体的参与,即配体与在间充质干细胞上表达的相应受体结合具有驱 动间充质干细胞归巢的作用。移植的干细胞顺利归巢至微环境,要求损伤部位的信号分子和间充质干细胞表面受体相一致,这也是决定干细胞移植的成败之一。目前研究最多的是基质细胞衍生因子1、CXC 趋化因子受体、肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor,HGF) 及其受体离散因子受体c-met(HGF/c-met)、单核细胞趋化蛋白(monocyte chemotactic protein,MCP)、CC趋化因子受体 (CCR)、黏附因子等。 

 

活化的间充质干细胞归巢路线图

图注:间充质干细胞在不同的解剖位置发挥着不同的功能(方形图里面的文字)。大量研究发现,除了骨髓来源,在外周血管及其他结缔组织中也能获得间充质干细胞(方形图中灰色文字列出)。大量归巢的路线以箭头方式表示,其中黑色箭头代表基于已发表文献论证的路线。炎症反应包含创伤、慢性炎症反应(如移植物抗宿 主病)和肿瘤等 



间充质干细胞表面广泛表达趋化因子和生长因子等受体,其归巢过程亦涉及趋化因子、黏附分子、生长因子和酶等多种配体及其受体的参与,即配 体与在间充质干细胞上表达的相应受体结合具有驱动间充质干细胞归巢的作用。移植的干细胞顺利归巢至微环境,要求损伤部位的信号分子和间充质干细胞表面受体相一致,这也是决定干细胞移植的成败之一。 目前研究最多的是基质细胞衍生因子1、CXC 趋化因子受体、肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor,HGF) 及其受体离散因子受体 c-met(HGF/c-met)、单核细胞趋化蛋白(monocyte chemotactic protein,MCP)、CC趋化因子受体 (CCR)、黏附因子等。


 CXC趋化因子家族 


基质细胞衍生因子1(stromal cell derived factor-1,SDF-1) 又称CXCL-12,是趋化因子家族中的CXC亚族。CXCR4是目前研究最多的SDF-1的受体,首先是在小鼠骨髓基质细胞分泌的细胞因子中发现的,同时在多种细胞表面表达,包括血液细胞、造血干细胞、胚胎干细胞。现有研究表明,趋化因子家族及其受体不但能介导白细胞的迁移,同时在间充质干细胞归巢中也发挥着重要作用,也是研究较多的细胞因子。SDF-1/CXCR4轴主要功能之一就是调节前体细胞的 移植、趋化及归巢至受伤的部位,是进化上高度保守的介导干细胞迁移分布的关键信号,在间充质干细胞募集和定向迁移中发挥了关键性作用。在间充质干 细胞归巢的研究过程中,相比其他几种趋化因子,SDF-1表现出更强的趋化能力,因此SDF-1及其受体CXCR4对间充质干细胞趋化的研究是目前的热点。 

国内外学者通过大量体内外实验发现SDF-1/ CXCR4轴在间充质干细胞归巢过程中起重要作用。科学家们发现SDF-1α/CXCR4轴调节移植的骨髓间充质干细胞迁移至大鼠脑缺血损伤部位。发现提高CXCR4的表达可能会增强间充质干细胞的迁移能力。Tang等研究发现,外源性血管内皮生长因子通过调节SDF-1/CXCR4轴促进心脏干细胞的募集修复心肌组织。有研究采用慢病毒转染将 CXCR4导入人骨髓间充质干细胞,体外Transwell迁移实验证实导入CXCR4的干细胞向SDF-1的迁移能 力显著增加。但也有研究发现,缺血性心肌病患者 血液中SDF-1水平升高和CD34+水平升高有一致性,与骨髓间充质干细胞无明显一致性。因此,该轴在间充质干细胞归巢的作用还有待进一步挖掘。 


 CC趋化因子家族 


近来研究发现,与趋化因子相关的间充质干细胞、MAPCs及部分干细胞,具有表达或者被诱导表达至少CCR1、CCR2、CCR3、CCR5其中之一的能力。

MCP-1(CCL2)、MCP-3(CCL7)、MIP-1α(CCL3)、MIP-1β(CCL4)、RANTES(CCL5)等属于趋化因子家族,对多种细胞都有趋化作用,主要是通过和它的特异性受体结合发挥生物学作用。现代研究发现,在机体损伤和炎症部位都可以上调MCP-1、MCP-3,目前在心血管病变中研究较多。Schenk等通过研究发现,实验动物心肌梗死1个月后梗死区大量表达MCP3,进行间充质干细胞移植治疗后,梗死区大量表达MCP-3的心脏功能明显比对照组改善显著。研究还发现,MCP-3大量募集间充质干细胞归巢至损伤部位,是通过促进心肌成纤维细胞和胶原基质的募集而进行心脏重建。Huang等通过基因修饰间充质干细胞,使其表面过表达MCP3受体CCR-1,间充质干细胞归巢至受损心肌的能力和存活率增强。Guo等发现,MCP-1/CCR2轴在间充质干细胞归巢治疗扩张 性心肌病中发挥作用,为治疗扩张性心肌病提供了新的治疗思路。


 HGF/c-met 


HGF即肝细胞生长因子,是一种间质源性生长因子,是从部分肝切除大鼠的血清中分离出的一种能刺激DNA合成和原代培养的因子,肝细胞生长因子受体是由原癌基因c-Met编码产生的一种 酪氨酸激酶,也被称为c-Met。HGF/c-met具有多种生物学作用,可以抗凋亡、促进增殖和血管再生,因 此在许多慢性病中具有抗纤维化、重建功能的作用。

肝细胞生长因子能够促使间充质干细胞增殖、迁移、分化。近来研究发现,肝细胞生长因子能通过HGF/c-met轴介导干细胞的靶向分布。Trapp等研究发现,HGF/c-met 介导无限制体干细胞 (unrestricted somatic stem cells,USCS)向损伤脑神经组织的趋化分布和定向分化作用,为神经细胞再生以及功能恢复提供可能。黄小兵等发现中药龟板含药血清可能通过HGF/c-met轴促间充质干细胞迁移。另外,肝细胞生长因子长期诱导可促进间充质干细胞分化。Liu等研究发现,HGF/c-met在间充质干细胞归巢至肠缺血再灌注肝损伤部位介导的干细胞修复发挥着重要作用。有学者通过基因转染技术将肝细胞生长因子基因转染间充质干细胞,前期的动物实验表明,转染肝细胞生长因子基因干细胞的实验组治疗效果明显高于对照组。


 黏附分子 


间充质干细胞动员和迁移后,血管中的间充质干细胞黏附于毛细血管壁跨内皮细胞层归巢至目标组织,间充质干细胞和细胞外基质通过表达细胞黏附分子配体与细胞黏附分子结合,介导干细胞归巢到特定的靶点。黏附分子是指由细胞产生存在于细胞表面介导细胞之间与基质间相互接触和结合的一类分子,包括选择蛋白家族、免疫球蛋白超家族和整联蛋白家族及其他未归类的黏附分子。目前所报道的有关间充质干细胞黏附到内皮组织具有重要功能的黏附分子有P-选择蛋白、整合素等。

有研究者观察发现,在遗传性缺乏P-选择蛋白的小鼠中,间充质干细胞在血管内沿着血管壁滚动行为明显减少,这表明P-选择蛋白可能与间充质干细胞沿血管壁滚动黏附有关。间充质干细胞表面存在多种整合素成员的表达,约50%人间充质干细胞上表达VLA-4,因此VLA-4/VCAM轴在归巢中研究较多。一些研究表明VLA-4除了可以调控间充质干细胞归巢中的黏附过程,同时也参与归巢其他步骤如捕获、滚动等,是间充质干细胞完成归巢过程不可或缺的成分。 研究发现肿瘤坏死因子α能够刺激血管上皮细胞和间充质干细胞,使两者的VCAM-1及其受体VLA-4表达增加,促进两者间的黏附和固定。吕浩敏等研究发现炎性因子能够增强大鼠骨髓间充质干细胞表面 VCAM-1的表达,同时可促进骨髓间充质干细胞与血管 内皮细胞的黏附,促进间充质干细胞向心肌梗死区迁移,可能与提高间充质干细胞表面VCAM-1有关。有研究表明,培养间充质干细胞的同时加入VCAM-1抗体后,间充质干细胞对心脏毛细血管内皮细胞的黏附力消失,提示VLA-4/VCAM轴在间充质干细胞黏附过程 中的重要作用。多个研究表明,当间充质干细胞表面 整合素减少时,归巢率明显减低。在间充质干 细胞的归巢研究中发现,应用抗体封闭VLA-4后的间充质干细胞归巢率显著降低。


 细胞外基质及其他因素 

细胞外基质的主要成分包括胶原、纤维素、硫酸类肝素和蛋白聚糖类等。细胞外基质对细胞的黏附、迁移、铺展、增殖、分化和凋亡等产生重要作用。碱性成纤维细胞生长因子在细胞外基质中含量较为丰富,有研究表明,碱性成纤维细胞生长因子可能通过激活蛋白激 酶B(Akt)信号通道增强间充质干细胞的迁移能力。

间充质干细胞的迁移受到多因素影响和多途径调控,有研究发现,Notch信号通路可以调控一些细胞上CXCR4和VLA-4的表达和功能,可能也参与了对间充质干细胞迁移的调控。 


 促进间充质干细胞归巢的策略 


越来越多研究表明,间充质干细胞能够选择性归巢于多种组织的损伤部位,利用各种措施提高干细胞归巢的效率,将会提高干细胞移植的效果。

间充质干细胞反复传代会导致其干性丢失,影响其治疗效果。间充质干细胞在体外发生老化以及细胞间的氧化损伤积累,使细胞的增殖和归巢潜能有所减弱。筛选优化间充质干细胞的分离培养方法是提高间充质干细胞归巢的一个重要切入点。靳建亮等发现原代骨髓间充质干细胞移植在小鼠急性心肌梗死治疗中的作用优于第5代骨髓间充质干细胞移植,同时发现经“骨髓细胞反复转移”方法培养的原代骨髓间充质干细胞移植,可以作为一种新的培养策略用于急性心肌梗死后的心肌组织再生。


 基因修饰的干细胞


基因修饰的干细胞具有干细胞治疗和基因治疗的双重优势,在生物治疗领域受到越来越多的关注, 转染有利于归巢的基因是提高间充质干细胞归巢的 另一个重要切入点。研究发现在间充质干细胞上转染 一些促进干细胞迁移、黏附的基因,将有利于干细胞的归巢。Chen等的研究发现,转染SDF-1/HOXB4 基因明显强化造血干细胞的迁移及其在小鼠体内的造血功能。孙瑞婷研究采用肝细胞生长因子修饰的间充质干细胞治疗放射性肠损伤,观察肝细胞生长因子基因修饰的人脐带间充质干细胞对放射性肠损伤的防治作用,并初步研究其作用机制,为基因修饰干细胞治疗放射性肠损伤提供了新的实验数据。 

 

植入途径的选择 


干细胞目前最主要的移植方式是动脉移植、静脉移植、心内移植和局部注射移植。有学者报道各个移植方式的优缺点,静脉注射常 发生静脉阻塞于肺部而影响疗效;动脉注射操作复杂,创伤大,出血多;局部注射归巢率高,疗效好。 这些仍需要通过大量实验数据证实。通过尾静脉和门静脉2种不同途径输注DAPI标记的间充质干细胞,观察DAPI阳性间充质干细胞在肝切除大鼠模型中向肝脏的归巢、定植,实验结果显示门静脉移植组间充质干细胞归巢到肝脏及定植多于尾静脉移植组,结果表明移植途径对间充质干细胞归巢、定植到肝脏有一定影响。为了准确观察不同途径移植的间充质干细胞在体内能否产生大量的肝细胞,在乳羊中分别经腹腔和肝脏途径移植成人骨髓间充质干细胞,研究发现,尽管两种途径均产生了大量的肝细胞,但与腹腔途径相比,肝内途径更为有效。


 促进间充质干细胞黏附贴壁及对靶向组织的处理


黏附贴壁是移植干细胞存活、生存和有效的前提。研究发现,在移植前使间充质干细胞处于黏附贴壁状态会有利于移植后的细胞生存和向目标组织的归巢。在体外用微载体扩增间充质干细胞时发现间充质干细胞集落成巢珠样,在移植后的凋亡明显少于经胰蛋白酶处理过的间充质干细胞。在细胞治疗的同时外加磁场能够促进间充质干细胞的停留、植入,进一步改善心肌梗死大鼠的心功能, 而且不存在细胞栓塞的风险。研究结果显示,细胞磁靶向治疗有望成为促进移植细胞归巢的新兴策略。 

尽管间充质干细胞植入体内后对血清和氧气的缺乏都十分敏感,但局部组织的缺血预处理可能反而提高间充质干细胞的归巢效率。因此,在间充质干细胞移植前或移植后对靶向组织进行相关处理可能会提高归巢率。经尾静脉移植间充质干细胞给正常裸鼠和慢性肝损伤裸鼠,结果前者肝脏内移植细胞植入率较后者明显减少,由此可见适度的肝脏内炎症环境对肝细胞再生修复、移植细胞归巢和分化都有促进作用。同时多个体外实验亦提示肝脏衰竭血清有促进干细胞生长和分化的作用。 


 移植时间、数量 


研究显示,移植时间及数量影响其归巢的效果,早期大量输注有助于提高其归巢率。在移植间充质干细胞之前通常需要在体外进行培养扩增以增加移植的干细胞数量。为了保持间充质干细胞的干性,细胞培养条件非常重要。有研究发现, 低氧条件下培养能够减少培养时氧化损伤的累积,增加基质金属蛋白酶的数量,但也有研究显示,间充质干细胞体外扩增会产生基质金属蛋白酶抑制剂3,从而 影响间充质干细胞的跨内皮细胞迁移。对比大量不同细胞培养基进行间充质干细胞体外扩增后发现,低糖DMEM、Glutamax和低密度的培养基可能更有利于间充质干细胞应用于细胞疗法。 


近年来大量间充质干细胞相关成果不断涌现,尤其是难治性疾病的研究和临床应用,干细胞具有不可替代的优势。大量研究表明,间充质干细胞的迁移和不同的细胞因子及其受体相关。目前研究最多的是SDF-1/CXCR4,MCP-1/CCR, HGF/c-Met,另外还有SCF-c-Kit,VEGF/VEGFR,PDGF/PDGFR,HMGB1/RAGE等与间充质干细胞的迁移、黏附相关。对基因和信号分子的进一步研究可能是明确间充质干细胞归巢机制的切入点。间充质干细胞归巢于靶向组织是间充质干细胞作为种子细胞应用于临床的前提,只有保证一定的归巢率,才能保证间充质干细胞的应用疗效,因此,积极开展促进归巢的策略也非常重要。


 间充质干细胞作为前沿的治疗方式,深入研究其归巢机制及影响因素,尤其是间充质干细胞动员的分子机制,对深入开展间充质干细胞的基础研究,建立体外细胞归巢体系,开展间充质干细胞及转基因后移植的体内效应研究等均具有重要的意义,也将有利于其更好得应用于临床。前文已经讨论归巢相关分子机制和促进间充质干细胞归巢的策略,相信经过不断的研究和努力,终究会完善归巢机制并在临床应用中寻找新的突破。间充质干细胞来源广泛,具有体外操作简单,造血支持和免疫调节作用明确等特点以及多向分化能力,具有广阔的前景。


参考文献   

http://www.crter.org/CN/article/openArticlePDF.jsp?id=11597





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